· 本文的通讯作者为香港大学的管轶教授，研究团队通过分析在广东、广西被走私的穿山甲样本发现，其身上的冠状病毒与现在引发流行的新冠病毒高度相似，穿山甲可能是新冠病毒的中间宿主。
· 穿山甲身上的冠状病毒属于新型冠状病毒相关冠状病毒的两个子谱系，迄今为止，穿山甲是除蝙蝠以外唯一被新型冠状病毒相关冠状病毒感染的哺乳动物。
在中国及其他地区，病毒性肺炎的持续爆发与一种新型冠状病毒有关。该爆发目前可能与中国武汉的海鲜市场有关，那里销售的野生动物可能是人畜共患病的传染源。尽管蝙蝠可能是新型冠状病毒的储存宿主，但尚不清楚任何有助于转移给人类的中间宿主的身份。在这里，我们报告了在中国南方的反走私行动中查获的穿山甲（Manis javanica）中新型冠状病毒相关冠状病毒的鉴定。宏基因组测序确定了与穿山甲相关的冠状病毒，它们属于新型冠状病毒相关冠状病毒的两个子谱系，其中一个在受体结合域上与新型冠状病毒密切相关。穿山甲冠状病毒的多个谱系及其与新型冠状病毒的相似性的发现表明，穿山甲应被视为该新型人类病毒的可能中间宿主，应从海鲜市场中移除以防止人畜共患病传播。
迄今为止，穿山甲是除蝙蝠以外唯一被新型冠状病毒相关冠状病毒感染的哺乳动物。令人惊讶的是，在穿山甲中发现了两个相关的CoV谱系，并且它们都与新型冠状病毒相关。这表明这些动物可能是这些病毒的长期宿主，这令人惊讶，因为穿山甲是数量相对较小的独居动物，这也反映了它们的濒危地位。但是，不能排除穿山甲独立于蝙蝠或其他动物宿主而获得了其新型冠状病毒相关病毒。还值得注意的是，穿山甲冠状病毒的两个谱系均从马来亚穿山甲中获得，这些穿山甲可能自东南亚的被贩运而来，并且我们对这种动物在其本土地区所维持的病毒多样性的认识十分缺乏。毫无疑问，穿山甲人群中病毒传播的程度尚需进一步调查，但在广西和广东省均发生新型冠状病毒相关冠状病毒感染的情况表明，该动物可能是冠状病毒出现的潜在重要宿主。
冠状病毒，包括与新型冠状病毒相关的冠状病毒，明显存在于亚洲的许多野生哺乳动物中。尽管穿山甲中冠状病毒的流行病学特征、致病性、种间传染性和可传播性尚待研究，但此处提供的数据强烈表明处理这些动物需要相当谨慎，应严格禁止在湿货市场中出售它们。为了了解它们在新型冠状病毒出现中的作用以及未来人畜共患病传播的风险，显然需要对中国和东南亚自然环境中的穿山甲进行进一步监测。
【摘要】
在中国及其他地区，病毒性肺炎的持续爆发与一种新型冠状病毒有关，该冠状病毒被临时称为新型冠状病毒。该爆发目前可能与中国武汉的海鲜市场有关，那里销售的野生动物可能是人畜共患病的传染源。尽管蝙蝠可能是新型冠状病毒的储存宿主，但尚不清楚任何有助于转移给人类的中间宿主的身份。在这里，我们报告了在中国南方的反走私行动中查获的穿山甲（Manis javanica）中新型冠状病毒相关冠状病毒的鉴定。宏基因组测序确定了与穿山甲相关的冠状病毒，它们属于新型冠状病毒相关冠状病毒的两个子谱系，其中一个在受体结合域上与新型冠状病毒密切相关。穿山甲冠状病毒的多个谱系及其与新型冠状病毒的相似性的发现表明，穿山甲应被视为该新型人类病毒的可能中间宿主，应从海鲜市场中移除以防止人畜共患病传播。
【正文】
据报道，2019年12月30日在中国武汉爆发了严重的肺炎疾病。病原很快被鉴定为新型冠状病毒——新型冠状病毒。病例数迅速增加，从2019年12月的27起增加到2020年1月30日的7,818起，导致世界卫生组织宣布突发公共卫生事件。许多早期病例与湖北省武汉市的华南海鲜市场有关，据推测可能来自人畜共患病源。目前，中国疾病预防控制中心仅报告从市场上获取的环境样本呈新型冠状病毒阳性。但是，由于2002-2003年的SARS疫情也有类似的湿货市场，因此看来野生动物也可能参与了新型冠状病毒的出现过程。确实，在爆发前，华南海鲜市场上有许多非水生哺乳动物可供购买。不幸的是，由于市场在疫情爆发后不久就被清理干净，因此从市场上确定野生动物中的源病毒具就有挑战性。尽管现已鉴定出新型冠状病毒与2013年从云南中菊头蝠蝙蝠中取样的冠状病毒密切相关，但尚未在其他野生动植物物种中检测到紧密相关的病毒。在这里，我们介绍了走私到中国南方的穿山甲中新型冠状病毒相关病毒的鉴定。
我们调查了穿山甲（鳞甲目哺乳动物）的病毒组成。这些动物的重要性和利益日益增长，因为它们是所有种类哺乳动物中最不合法贩运的动物：它们既被用作食物来源，其鳞甲也被用作传统中药。现在，在国际自然保护联盟濒危物种红色名录中，许多穿山甲物种被视为极度濒危。我们收到了2017年8月至2018年1月从18个马来亚穿山甲（Manis javanica）收集的冷冻组织（肺，肠，血液）样本。这些穿山甲是广西海关在反走私行动中获得的。令人惊讶的是，其RNA的高通量测序表明在43个样品中的6个（2个肺，2个肠，1个肺-肠混合液，1个血液）中存在冠状病毒。利用基因序列读取数据，并通过扩增子测序填补空白，我们能够获得6个完整的或几乎完整的基因组序列——分别表示为GX / P1E，GX / P2V，GX / P3B，GX / P4L，GX / P5E和GX / P5L，在系统发育分析中属于新型冠状病毒谱系（在乙型冠状病毒属内）。这些病毒也具有与新型冠状病毒类似的基因组结构，具有9个预测的开放阅读框架（图1b；扩展数据表S5）。我们还能够使用Vero E6细胞系成功分离出病毒（扩展数据图S1）。
图1
图1.系统发育分析，描述了人类新型冠状病毒，本研究中获得的穿山甲冠状病毒序列与其他参考冠状病毒之间的进化关系。使用最大似然方法，使用GTR + I + G核苷酸取代模型和1,000个bootstrap重复序列来估计系统发育。 （A）从串联的ORF1ab-S-E-M-N基因估计的Sarbecovirus亚种（β-冠状病毒）的系统发育。红色圆圈表示在这项研究中产生的穿山甲冠状病毒序列。请注意，GD / P1L是从先前发布的原始数据重新组装的共有序列。（B）冠状病毒的基因组组织，包括穿山甲冠状病毒，其预测的ORF以不同的颜色显示。 （C）对新型冠状病毒，穿山甲冠状病毒和蝙蝠冠状病毒RaTG13之间序列相似性变化模式的滑动窗口分析。查询序列的名称垂直显示在分析框的右侧。与不同参考序列的相似性由顶部图例框中显示的不同颜色指示。将广东穿山甲冠状病毒GD / P1L和GD / P2S合并进行此分析。顶部的蓝色箭头指示ORF在分析的比对中的位置。潜在的重组断点以粉红色虚线显示，将基因组一起切成八个区域（省略了<200bp的区域；底部用红线表示），用于系统发育分析。 （D）不同基因组区域的系统发育树。 SARS-CoV和新型冠状病毒相关谱系以蓝色和红色树枝显示。分支比例尺为0.1个替换/位点。
扩展数据图S1
基于这些新的基因组序列，我们设计了用于qPCR检测的引物，以确认原始样品对冠状病毒呈阳性。我们对2018年5月至7月之间收集的另一批穿山甲样本进行了进一步的qPCR测试。在从12只动物中获得的19个样本（9个肠道组织，10个肺组织）中，3个肺组织样本呈冠状病毒阳性。
除了来自广西的动物外，在新型冠状病毒爆发开始后，广州海关技术中心重新检查了他们先前在2019年3月反走私中获得的5份已存档的穿山甲样本（2张皮肤拭子，1个未知组织，1个鳞甲）。在进行高通量测序后，发现该标本样品含有冠状病毒读段，并且根据这些数据，我们能够组装一个21,505bp的部分基因组序列（表示为GD / P2S），约占新型冠状病毒基因组的72%。实际上，鳞甲上的这种病毒序列可能来自其他受感染穿山甲组织的污染物。值得注意的是，2019年在广东进行的另一个患病穿山甲的研究，也从肺部样本中鉴定出与新型冠状病毒类似相关的病毒基因重叠群。研究人员使用不同的组装方法和手动审编，以生成部分基因组序列，该序列占全长病毒基因组的约86.3％（在图1a树中表示为GD / P1L）。
这些新的穿山甲冠状病毒基因组与新型冠状病毒有大约85.5％至92.4％的相似性，并在系统树中代表了新型冠状病毒的两个亚谱系，其中之一（GD / P1L和GDP2S）与新型冠状病毒密切相关（图1；红色圆圈）。先前已经注意到，Sarbecovirus属的成员经历了广泛的重组。为了支持这一点，在这里进行的重组分析显示蝙蝠冠状病毒ZC45和ZCS21可能是重组体，包含来自多个SARS-CoV相关谱系（基因组区域2、5、7）和新型冠状病毒相关谱系（包括穿山甲的谱系）的基因组片段（区域1、3、4、6、8）。
然而，更值得注意的是在穿山甲冠状病毒、蝙蝠冠状病毒RaTG13和人新型冠状病毒之间观察到了推测的重组信号（图1c，d）。尤其是，新型冠状病毒在受体结合域中与广东穿山甲冠状病毒表现出非常高的序列相似性（RBD；97.4％氨基酸相似性；图1c和图2a中的红色箭头表示），即使它在剩余基因组与蝙蝠冠状病毒RaTG13最为相似。蝙蝠冠状病毒RaTG和人类新型冠状病毒在RBD中的氨基酸相似度仅为89.2％。实际上，广东穿山甲冠状和新型冠状病毒在RBD的五个关键残基处具有相同的氨基酸，而RaTG13仅与新型冠状病毒共享一个氨基酸（残基442，人SARS-CoV编号9）。有趣的是，对RBD中仅同义位点的系统发育分析表明，广东穿山甲的系统发育位置与剩余病毒基因组的系统发育位置一致，而不是新型冠状病毒的最接近亲缘关系（图2b）。因此，广东穿山甲冠状病毒和新型冠状病毒的氨基酸相似性可能是由于选择性介导的趋同进化而不是重组引起的，尽管很难在当前数据的这些情况之间进行选择。尽管尚不清楚任何趋同进化的驱动因素，但其发生可能以及重组的发生可能，将进一步突显中间动物宿主在人类病毒出现中所扮演的角色。
图2
图2.（A）序列比对显示人，穿山甲和蝙蝠冠状病毒中的受体结合域（RBD）。 根据Wan等，在SARS-CoV RBD和人ACE2蛋白之间结合的五个关键残基用红色框表示，而与ACE2接触的残基用黄色框表示。 注意，广东穿山甲序列，编码氨基酸337脯氨酸，420天冬氨酸，499脯氨酸和519天冬酰胺的密码子位置具有歧义的核苷酸组成，可能分别导致苏氨酸，甘氨酸，苏氨酸和赖氨酸的替代氨基酸。 广东：广东，广州：广西。 （B）从整个RBD区域（上）和仅同义位点（下）估计的新型冠状病毒相关谱系的系统树。 显示了从1,000个引导程序副本获得的分支支持。
迄今为止，穿山甲是除蝙蝠以外唯一被新型冠状病毒相关冠状病毒感染的哺乳动物。令人惊讶的是，在穿山甲中发现了两个相关的CoV谱系，并且它们都与新型冠状病毒相关。这表明这些动物可能是这些病毒的长期宿主，这令人惊讶，因为穿山甲是数量相对较小的独居动物，这也反映了它们的濒危地位。但是，不能排除穿山甲独立于蝙蝠或其他动物宿主而获得了其新型冠状病毒相关病毒。还值得注意的是，穿山甲冠状病毒的两个谱系均从马来亚穿山甲中获得，这些穿山甲可能自东南亚的被贩运而来，并且我们对这种动物在其本土地区所维持的病毒多样性的认识十分缺乏。毫无疑问，穿山甲人群中病毒传播的程度尚需进一步调查，但在广西和广东省均发生新型冠状病毒相关冠状病毒感染的情况表明，该动物可能是冠状病毒出现的潜在重要宿主。
冠状病毒，包括与新型冠状病毒相关的冠状病毒，明显存在于亚洲的许多野生哺乳动物中。尽管穿山甲中冠状病毒的流行病学特征、致病性、种间传染性和可传播性尚待研究，但此处提供的数据强烈表明处理这些动物需要相当谨慎，应严格禁止在湿货市场中出售它们。为了了解它们在新型冠状病毒出现中的作用以及未来人畜共患病传播的风险，显然需要对中国和东南亚自然环境中的穿山甲进行进一步监测。
【方法】
经伦理学批准（野生动物救治规定[2011] 85），广西壮族自治区陆生野生生物救助和流行病监测中心对所研究的动物进行了救治。按照程序指南（穿山甲救援程序，2016年11月）收集样品。
广西穿山甲的样品采集，病毒检测和测序
我们在2017年8月至2018年1月间从中国广西医科大学收集了18株穿山甲（Manis javanica）的冷冻组织样本。这些穿山甲被广西海关在日常反走私行动中查获。所有动物个体均包含来自包括肺，肠和血液在内的多个器官的样品，除了6只仅可获得肺组织的个体，5只仅具有肠和肺组织混合的个体，1只仅具有肠组织的个体和1只包含2个血样的个体。 使用肠-肺混合样本，我们能够使用Vero-E6细胞系分离出新型的乙型冠状病毒（扩展数据图S1）。使用高纯病毒RNA试剂盒（瑞士罗氏）对所有43个样品进行RNA提取。对于RNA测序，使用Ion Total RNA-Seq Kit v2 （赛默飞世尔科技公司，MA，美国）构建测序文库，然后使用Ion Torrent S5测序仪（赛默飞世尔科技）对文库进行测序。使用SuperScript III第一链合成系统（赛默飞世尔科技，MA，美国）进行逆转录用于RT-PCR。使用NEBNext Ultra II DNA库制备试剂盒构建DNA库，并在MiSeq测序仪上测序。 NGS QC工具包V2.3.3用于删除低质量和短读的内容。利用NCBI / GenBank可获得的数据，将BLASTn和BLASTx都用于搜索本地病毒数据库。使用CLC Genomic Workbench v.9.0组装基因组序列。为了填补高通量测序中的空白并获得整个病毒基因组序列，设计了基于蝙蝠SARS样冠状病毒ZC45（GenBank登录号MG772933）序列的扩增子引物，用于基于扩增子的测序。
总共6个样本（包括病毒分离株）包含与乙型冠状病毒匹配的读数（扩展数据表S1）。我们从这些样品中获得了近完整的基因组（与新型冠状病毒相比，达到98％），病毒基因组分别表示为GX / P1E，GX / P2V，GX / P3B，GX / P4L，GX / P5E和GX / P5L。基于这些基因组序列，我们设计了用于qPCR的引物，以确认原始组织样品的阳性（扩展数据表S4）。除了6个带有冠状病毒读数的原始样本外，这还显示了一个原始肺组织样本，该样本也是qPCR阳性的。我们进一步从广西医科大学的研究小组于2018年5月之间采样的12种走私穿山甲中检测了另外19个样品（9个肠组织，10个肺组织）。 GX / P1E，GX / P2V，GX / P3B，GX / P4L，GX / P5E和GX / P5L的基因组序列已提交给GenBank和GISAID数据库，其登录号一经生成便可以使用。
扩展数据表S1
广东穿山甲的样品采集、病毒检测和测序
在新型冠状病毒爆发开始后，广州海关技术中心重新检查了他们在2019年3月进行的反走私行动中获得的5份穿山甲样品（2支皮肤拭子，2种未知组织，1个鳞甲）。自所有五个样品提取RNA（美国，Qiagen），并由中国广东省Vision Medicals在Illumina HiSeq平台上进行了高通量RNA测序。使用BLAST方法发现量表样本包含冠状病毒读数。这些读物通过重新评估（MEGAHIT v1.1.312）和使用参考（BWA v0.7.1313）组装方法（以BetaCoV / Wuhan / WIV04 / 2019为参考）进行了质量评估、清洗和组装成重叠群。合并重叠群，并获得约72％的冠状病毒基因组（21,505bp）。该序列被称为穿山甲冠状病毒GD / P2S。
刘等人最近发表了一项穿山甲的宏转录组研究，并将21个RNA-seq原始文件保存在SRA数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）中。我们使用BLAST方法筛选了这些原始读取文件，发现其中五个（SRR10168374，SRR10168376，SRR10168377，SRR10168378和SRR10168392）包含了映射到新型冠状病毒的读取。对这些读数进行质量评估、清理，然后使用MEGAHIT12重新组装，并使用BWA13作为参考组装。然后将这些读段合并并整理到堆积比对文件中，以获得共有序列。该组合的共有序列长度为25,753bp（约占BetaCoV /Wuhan/ WIV04 / 2019的86.3％），并表示为穿山甲CoV GD / P1L。值得注意的是，它与GD / P2S序列具有66.8％的重叠且仅0.21％的差异（即序列鉴定为99.79％）。由于它们的遗传差异非常低，为了进行重组分析，我们将GD / P1L和GD / P2S序列合并为单个共有序列，以最大程度地减少任何序列中的缺口区域。广西和广东穿山甲冠状病毒的病毒基因组构造与新型冠状病毒相似。他们共有9个开放阅读框（ORF），并且共享相同的ORF1ab复制酶，包膜糖蛋白峰（S），包膜（E），膜（M），核衣壳（N）和其他预测的ORF的基因顺序。扩展表S5提供了ORF长度和与新型冠状病毒和蝙蝠冠状病毒RaTG13的相似性的详细比较。
基因序列、系统发育和重组分析
于2020年1月17日从Virological.org（http://virological.org）和GISAID（https://www.gisaid.org）数据库下载了人类新型冠状病毒和蝙蝠RaTG13冠状病毒基因组序列。由提交者共享（扩展数据表S2）。从GenBank（扩展数据表S3）下载了其他冠状病毒（Sarbecovirus属），并与此处获得的进行了比较。我们使用MAFFT v7.27314构建了完整基因组和单个基因的多序列比对。使用PhyML v3.115估算了最大似然系统发育，并利用具有1,000个引导复制的核苷酸取代的GTR + I + G模型。为了研究潜在的重组事件，我们实施了窗口滑动方法来确定查询序列和参考序列之间序列相似性和系统发生聚类的变化模式，以及直接从多序列比对中进行的系统发生聚类的扫描。如上所述，使用PhyML从每个窗口提取（即基因组区域1至8）中估计最大似然树。
扩展数据表S2
扩展数据表S3
扩展数据表S4
扩展数据表S5
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.13.945485v1
本文来源：网易公开课
作者：2020/02/18 管轶，香港大学，等
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