消化系统是2019新型冠状病毒感染的潜在途径

· 这篇论文是国内发表的学术论文中，首次提出并论证消化系统是冠状病毒感染的潜在途径

· 新冠病毒是和人体细胞中的血管紧张素转换酶的受体结合进入细胞的，这种酶在呼吸系统的上皮细胞中有高表达；这项研究这分析表明，消化系统的食管、回肠和结肠吸收性肠的上皮细胞中，也有这种酶的高表达

来自海军军医大学第二、第三附属医院的研究人员联合清华大学、同济大学的研究人员，对新型冠状病毒在消化系统的感染情况进行了研究。本研究为人们可能通过呼吸道和消化系统感染2019新型冠状病毒提供了生物信息学证据，有助于临床医生预防和治疗2019新型冠状病毒感染，并能对我们制定有关预防2019新型冠状病毒感染的健康政策产生重大影响。

与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）一样，2019新型冠状病毒也是通过细胞受体血管紧张素转换酶2（ACE2）进入主细胞。为了分析ACE2表达细胞的组成和比例，探索2019新型冠状病毒在消化系统感染中的可能途径，对4组肺、食管、胃、回肠和结肠的单细胞转录体进行了分析。结果表明，ACE2不仅在肺AT2细胞、食管上皮细胞和复层上皮细胞中有高表达，而且在回肠和结肠吸收性肠上皮细胞中也有高表达。这些结果表明，消化系统和呼吸系统是2019型新冠状病毒感染的潜在途径。

为了探讨2019新型冠状病毒的感染途径及ACE2在消化系统感染中的作用，我们在公共数据库的基础上，通过单细胞转录体鉴定了正常人肺和胃肠系统中ACE2表达的细胞组成和比例。一个引人注目的发现是，ACE2不仅在肺AT2细胞中表达，而且在食管上部和分层上皮细胞以及回肠和结肠吸收性肠上皮细胞中也有表达。此外，2019新型冠状病毒的肠道症状可能与侵袭的ACE2的肠表达细胞有关。这些发现表明，消化系统和呼吸道可能是2019新型冠状病毒感染的潜在途径。

摘要（Abstract）

自从2019年12月起，一种新型冠状病毒（2019新冠状病毒，2019-nCov）在中国湖北省最大省份之一——武汉，引起了肺炎的爆发，并引起了对公共卫生事件的重大关注。与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）一样，2019新型冠状病毒也是通过细胞受体血管紧张素转换酶2（ACE2）进入主细胞。为了分析ACE2表达细胞的组成和比例，探索2019新型冠状病毒在消化系统感染中的可能途径，对4组肺、食管、胃、回肠和结肠的单细胞转录体进行了分析。结果表明，ACE2不仅在肺AT2细胞、食管上皮细胞和复层上皮细胞中有高表达，而且在回肠和结肠吸收性肠上皮细胞中也有高表达。这些结果表明，消化系统和呼吸系统是2019型新冠状病毒感染的潜在途径。综上所述，本研究为人们可能通过呼吸道和消化系统感染2019新型冠状病毒提供了生物信息学证据，并可能对我们制定有关预防2019新型冠状病毒感染的健康政策产生重大影响。

介绍（Introduction）

2019年底，中国最大城市之一——武汉出现了越来越多的不明原因肺炎患者，并迅速蔓延到全国各地。一种新型冠状病毒随之从人气道上皮细胞中分离出来，命名为2019新型冠状病毒（2019-nCoV）。全基因组序列揭示了2019新型冠状病毒与蝙蝠（bat-SL-CoVZC45，MG772933.1）中检测到的SARS型病毒86.9%的核苷酸序列有同源性。通过成对蛋白质序列分析，结果表明2019新型冠状病毒是SARS相关冠状病毒（SARSr-CoV）的其中一类。

至于2019新型冠状病毒感染的临床表现，发热和咳嗽是发病时最常见的症状。此外，它经常引起严重的肠道症状，如腹泻和恶心，甚至比SARS病毒和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）更严重。然而，人们对2019新型冠状病毒引起肠道症状的原因和方式知之甚少。此外，2019年新型冠状病毒是否能通过呼吸道以外的消化道传播尚不清楚。

冠状病毒感染的前提是进入宿主细胞。在此过程中，刺针型（S）糖蛋白识别宿主细胞受体并诱导病毒和细胞膜融合。2019新型冠状病毒感染时，一种金属肽酶血管紧张素转换酶II（ACE2）被证明是细胞受体，与SARS病毒感染一样。2019新型冠状病毒可进入ACE2的表达细胞，但不能进入没有ACE2的细胞或具有其他冠状病毒受体的细胞，如氨基肽酶N和二肽基肽酶。因此，ACE2在2019新型冠状病毒感染中起着至关重要的作用。

为了探讨2019新型冠状病毒的感染途径及ACE2在消化系统感染中的作用，我们在公共数据库的基础上，通过单细胞转录体鉴定了正常人肺和胃肠系统中ACE2表达的细胞组成和比例。一个引人注目的发现是，ACE2不仅在肺AT2细胞中表达，而且在食管上部和分层上皮细胞以及回肠和结肠吸收性肠上皮细胞中也有表达。此外，2019新型冠状病毒的肠道症状可能与侵袭的ACE2的肠表达细胞有关。这些发现表明，消化系统和呼吸道可能是2019新型冠状病毒感染的潜在途径，将会对我们制定有关预防2019新型冠状病毒感染的健康政策产生重大影响。

材料和方法（Materials and Methods）-数据来源（Data Sources）

肺、食道、胃、回肠和结肠的单细胞表达矩阵来自基因表达数据库（GEO；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、单细胞入口（https://Single cell.broadinstitute.org/Single-u cell）和人类细胞图谱数据入口（http://data.humancellatlas.org）。食管和肺的单细胞数据来自E. madisson等人的研究，其中包含6个食管和5个肺组织样本。胃粘膜样本的数据来自GSE134520的3例非萎缩性胃炎和3例慢性萎缩性胃炎患者。GSE134809由11例回肠克罗恩病患者的22个回肠样本组成，仅选择非炎症样本进行分析。Christopher S等人的研究包括12个正常结肠样本。

质量控制（Quality Control）

去除表达基因低于200或大于5000的低质量细胞。我们进一步要求线粒体或核糖体基因的UMIs比例低于20%。

数据集成、降维和单元聚类（Data Integration, Dimension Reduction and Cell Clustering）

根据下载的数据，对不同的单细胞项目进行了不同的数据处理方法。

食道和肺数据集：Seurat rds数据直接从E.madisson al的研究补充材料中下载。采用均匀流形近似和投影（UMAP）可视化方法获得细胞簇。

胃和回肠数据集：用R安装包Seurat（3.0版）处理单细胞数据表达矩阵。我们首先利用“归一数据” 规则和单细胞基因表达数据。将UMI计数标准化为每个单元的UMI总数，乘以10000进行标准化，并转换为对数转换计数。利用Find Variable Genes（发现变量基因）功能鉴定高变基因（HVGs）。然后，我们使用Find Integration Anchors和Integrate data函数合并每个数据集中的多个样本数据。在去除单个细胞数据集中不需要的变异源（如细胞周期阶段或线粒体污染）后，我们使用RunPCA函数对具有显著HVGs的单个细胞表达矩阵执行主成分分析（PCA）。然后利用Find Neighbors函数构造了PCA空间中基于欧几里德距离的K近邻图，并利用最优分辨率的Find Clusters函数将Louvain算法应用于迭代群单元。UMAP用于可视化目的。

结肠数据集单细胞数据表达矩阵用R安装包LIGER和Seurat处理。我们首先将数据标准化，以解释细胞间测序深度和捕获效率的差异。然后利用select Genes函数分别识别每个数据集上的可变基因，并对结果进行联合。下一步，使用LIGER中的优化函数，进行整合的非负矩阵因子分解，以识别数据集中的共享和不同的基因，以及每个细胞对应的因子负荷。我们选择k为15，lambda为5.0，得到一个期望的对齐图。然后，我们使用quantile Align SNF函数确定了在数据集之间共享的集群，并在每个集群和因子中对齐了分位数。接下来在Seurat中使用RunUMAP函数进行非线性降维，并用UMAP显示结果。

细胞类型鉴定及基因表达分析（Identification of cell types and Gene expression analysis）

我们根据已知细胞标记的表达和文章中提供的聚类信息来标注细胞簇。然后我们在Seurat中使用“RunALRA“功能将缺失的值输入scRNA-seq数据中。利用Seurat绘制特征图和小提琴图，显示输入的基因表达。为了比较不同数据集中的基因表达，我们在R安装包预处理（R包版本1.46.0 https://github.com/bmbolstad/preprocessCore）中使用了“分位数标准化”对数据进行预处理。然后对基因表达数据进行进一步的去噪处理，对正态分布进行随机生成，平均值等于平均值，标准差等于标准差。

结果（Results）-单元类型注释（Annotation of cell types）

胃肠系统由食道、胃、回肠、结肠和盲肠组成。在这项研究中，我们分析了4个数据集，包括食道、胃、回肠和结肠的单细胞转录体，以及肺（附件）。在细胞游程输出的基础上，利用基因表达计数矩阵，根据不同的器官或特定的细胞簇来呈现细胞的序列聚类。每个簇中的细胞类型标识由已知细胞类型标记的表达式进行注释。

在食管中，通过87947个细胞鉴定出14种细胞类型。90%以上的细胞分为四种主要的上皮细胞类型：上、复层、基底上和基底上的分裂细胞（图1A）。上皮基底层的附加细胞更接近于腺管和粘液分泌细胞。淋巴管和内皮细胞与血管组织有关。食道中的免疫细胞包括T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞（dc）和肥大细胞。

经质量控制，共鉴定出29678个细胞和10种细胞类型，其中胃上皮细胞比例较高，包括胃窦基底腺粘液细胞（GMCs）、胃底粘液细胞（PMCs）、主细胞和肠内分泌细胞（图1B）。非上皮细胞系由T细胞、B细胞、髓细胞、成纤维细胞和内皮细胞组成。

质量控制后，回肠中有50286个细胞和10种细胞类型（图1C）。检测细胞类型包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和肠内分泌细胞。所鉴定的免疫细胞类型包括髓样细胞、CD4+T、CD8+T和自然凶手T（NKT）细胞，以及血浆和B细胞。在11218个上皮细胞中，共鉴定出5种细胞类型，即吸收型肠上皮细胞、前体吸收型肠上皮细胞、杯状上皮细胞、盘状上皮细胞和未分化上皮细胞（图1D）。

所有来自结肠的47442个细胞在质量控制后都进行了注释（图1E）。上皮细胞中有吸收和分泌簇。吸收簇包括运输放大（TA）细胞（TA 1，TA 2）、未成熟肠细胞和肠细胞的进一步子簇。分泌簇包括祖细胞（分泌TA，未成熟杯状细胞）和成熟细胞（杯状细胞和肠内分泌细胞）的子簇。在最后的UMAP中还发现了神经节细胞和循环TA细胞。

细胞类型特异性ACE2表达（Cell type-specific ACE2 expression）

关于胃，ACE2在所有簇中的表达相对较低（图2B，C）。选定的细胞类型特异性标记基因用于识别胃中的每个簇（图2C）。MUC6和TIFF1在所有的簇中都高度表达。PGA4与CHGB、CD34、CD79A、CD8A和PRF1、VCAN和COL1A1、CD79A和CD79A、CD8A和PRF1、CD79A和CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、。

至于食道，ACE2在上皮细胞的上层和分层中高度表达（图3B，C）。腺体中ACE2的表达也很低（图3C）。所选的细胞类型特异性标记基因用于识别食道中的每个簇（图3C）。ECM1在上皮细胞中高表达。KRT4和krt5主要存在于复层上皮细胞中。KI67用于鉴别上皮细胞分裂，MUC5B和KRT23用于腺体，COL1A1和DCN用于基质细胞，VWF和PECAM1用于淋巴管和内皮细胞。用TPSB2、FCN1、CD79A、GNLY、CD27和CD3E作免疫细胞，如髓细胞、DC、B、T和肥大细胞。

在回肠上皮细胞中，ACE2在吸收性肠细胞中高表达，在祖细胞中低表达，这与结肠中的类似（图4B，C）。所选的细胞类型特异性标记基因也被用于鉴定回肠上皮细胞（图4C）。SEC2A5主要存在于肠吸收细胞和前体吸收细胞中。除吸收性肠上皮细胞外，其余上皮细胞均可见CD24。MII67和AMACR分别在未分化细胞和Paneth细胞中高表达。BCAS1用于鉴定未分化细胞，AMACR用于Paneth。

在结肠中，ACE2主要存在于肠细胞中，在未成熟肠细胞中表达较少（图5B，C）。选定的细胞类型特异性标记基因用于识别结肠中的每个簇（图5C）。AQPB主要存在于肠上皮细胞和未成熟肠上皮细胞中。此外，ZG16和ITLN1在杯状物和未成熟杯状物中高度表达。APOE在TA2和分泌型TA中均有表达。CD27和TPH1检测肠内分泌，SPC25检测TA循环。在最初的质量控制之后，在肺中识别出57020个细胞和25种细胞类型（图6A）。检测到的细胞类型包括纤毛细胞、肺泡1型（AT1）和肺泡2型（AT2）细胞、成纤维细胞、肌肉细胞和内皮细胞。所鉴定的免疫细胞类型为T、B和NK细胞，以及巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞（DC）。ACE2主要在AT2细胞中表达，在AT1和成纤维细胞中也有表达（图6B）。

在正常消化系统和肺的所有ACE2表达细胞中，回肠和结肠的ACE2表达高于肺和食管（图6C）。

Discussion（讨论）

冠状病毒是人类和其他哺乳动物上呼吸道、胃肠道和中枢神经系统的常见感染源。二十一世纪初，SARS-CoV和MERS-CoV两种β-冠状病毒引起了持续的公众恐慌，成为最重要的公共卫生事件。2019年12月，一种新发现的冠状病毒（2019-nCov）在中国湖北武汉引发了一场持续的肺炎爆发，感染人数不断上升。到目前为止，其感染途径和消化系统感染尚不清楚。在本研究中，我们发现2019新型冠状病毒的细胞进入受体ACE2在肺AT2细胞、食道上层上皮细胞和分层上皮细胞以及回肠和结肠的吸收性肠上皮细胞中高表达，表明不仅呼吸系统而且消化系统是潜在的感染途径。此外，2019新型冠状病毒的肠道症状可能与侵袭的表达ACE2的肠细胞有关。

一般来说，许多呼吸道病原体，如流感、SARS-CoV和SARSr-CoV，都会引起肠道症状，2019新型冠状病毒也是如此。SARS作为一种典型的呼吸道冠状病毒，常与呼吸道症状一起引起肠道症状。此外，大便传播也是SARS被忽视的风险。在SARS和流感高致病性菌株感染期间，它们的肠道症状与肠道脂多糖（LPS）通透性增加和细菌通过胃肠壁的传播有关。但2019新型冠状病毒引起肠道症状的机制尚不清楚。

最近的一项研究显示，与SARS病毒和MERS病毒相似，ACE2是2019新型冠状病毒的细胞进入受体。以前，ACE2是从SARS病毒许可的Vero E6细胞中分离出来的。它可以与SARS冠状病毒CTD1的受体结合区（RBD）相互作用，促进有效的跨物种感染和人与人之间的传播。CTD1的“向上”和“向下”转变通过调节CTD1、CTD2、S1-ACE2复合物和S2亚单位之间的关系来允许ACE2结合。在人HeLa（海拉癌细胞株）细胞方面，从人、麝猫和中国马蹄蝠中表达ACE2可以帮助多种SARSr病毒，包括2019新型冠状病毒进入细胞，表明ACE2在细胞进入中的重要作用。在治疗上，抗ACE2抗体可以阻断病毒在Vero E6细胞上的复制。

通过分析ACE2在正常人胃肠系统和肺组织中的表达，我们发现ACE2在肺AT2细胞、食管上皮细胞、复层上皮细胞和回肠、结肠吸收性肠上皮细胞中有高表达。与之前的研究相似，ACE2在AT2细胞中表达较多，而在正常肺的AT1细胞中表达较少。在肺泡中，AT1上皮细胞负责气体交换，AT2细胞负责表面活性剂的生物合成和自我更新。在SARS病毒感染中，AT2是病毒抗原和分泌囊泡检测的主要感染细胞类型。它在AT2细胞中的表达在不同的供体中是可变的，这可能与不同的易感性和严重性有关。因此，我们认为AT2细胞可能是肺中2019新型冠状病毒侵入细胞的关键，其数量可能与呼吸系统症状的严重程度有关，这可以解释无症状的2019新型冠状病毒携带者的存在。

ACE2在食管上皮细胞中也有高表达。组织学上，食道和呼吸系统器官，如气管和肺，都起源于中段前肠的前部。在与邻近的呼吸系统分离后，食道随后经历简单的柱状到复层鳞状上皮转化的形态发生。复层鳞状上皮可由粘膜下腺体滋养，并维持研磨性生食的通过。在Barrett食管（BE）中，酸反流引起的食管炎和多层上皮（MLE）与上上皮细胞和复层上皮细胞均相关。

在消化系统中，除食管上皮细胞和复层上皮细胞外，回肠和结肠吸收性肠上皮细胞中也发现ACE2，这是最脆弱的肠上皮细胞。在微生物感染中，肠上皮细胞起屏障作用，有助于协调免疫反应。吸收性肠细胞可被冠状病毒、轮状病毒和诺如病毒感染，通过破坏吸收性肠细胞、吸收不良、肠分泌不平衡和激活肠神经系统而导致腹泻。因此，我们认为腹泻的肠道症状可能与侵袭的表达ACE2的肠细胞有关。此外，由于细胞受体ACE2在食管上部和分层上皮细胞以及回肠和结肠吸收性肠上皮细胞中的高表达，我们推测2019新型冠状病毒可侵入消化系统并作为感染途径。

结论（Conclusion）

本研究为人们可能通过呼吸道和消化系统感染2019新型冠状病毒提供了生物信息学证据，有助于临床医生预防和治疗2019新型冠状病毒感染。

通讯作者：Hao Zhang，海军军医大学第二附属医院

发布日期：2020年1月31日

发布渠道：bioRxiv

原文地址：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.30.927806v1

原文标题：The digestive system is a potential route of 2019-nCov infection: a bioinformatics analysis based on single-cell transcriptomes

译者：小硕 | 网易公开课